Cinética Enzimática
Introdução
Falar de cinética enzimática, é o mesmo que falar das
relações químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção.
Quando nos fazemos um estudo sobre a cinética enzimática, nos permite elucidar
os pormenores do mecanismo catalítico. Neste trabalho, falaremos da cinética
enzimática, enzimas que são substâncias do grupo de proteínas e atuam como
catalisadoras de reacção, mecanismos enzimáticos, reação catalisada, ensaios
enzimáticos, factores que afetam a actividade das enzimas, Actividade
Enzimática, Importância
prática das constantes cinéticas, Inibição enzimática, Inibidores revertíveis, Inibidores
irreversíveis.
Cinética Enzimática
A cinética
enzimática estuda as reações químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção. O estudo da cinética de
uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo catalítico, o seu
papel no metabolismo, como é controlada a
sua actividade na célula e como pode ser inibida a
sua actividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro tipo de moléculas.
Enzimas
As enzimas são substâncias do grupo das proteínas e
atuam como catalisadores de reações químicas. As enzimas são
específicas para seus substratos, e o reconhecimento do substrato pela enzima é
altamente eficiente (MASTOTROENI; GERN. 2008: 59).
Um
substrato pode unir-se ao centro catalítico da enzima que o reconheça e
transformar-se num produto ao longo de uma série de passos denominados mecanismo
enzimático. Algumas enzimas podem unir vários substratos diferentes e/ou
libertar diversos produtos, como é o caso das próteses ao romper uma proteína em dois polipéptidos. Noutros casos, produz-se a união simultânea de dois
substratos, como no caso da DNA
polimerase, que é capaz de incorporar
um nucleótido (substrato 1)
a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos
sigam usualmente uma complexa série de passos, também podem apresentar um passo
limitante que determina a velocidade final de toda a reacção. Este passo
limitante pode consistir numa reacção química ou numa mudança de forma da
enzima ou do substrato (Idem).
O
conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas é útil na interpretação
dos dados cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem
unidos substrato e produto durante a catálise, que mudanças de forma ocorrem durante a reacção, ou
mesmo o papel em particular de determinados aminoácidos no mecanismo catalítico. Algumas enzimas
modificam a sua forma significativamente durante a reacção, em cujo caso pode
ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido
(costumam usar-se análogos que se unem mas não permitem levar a cabo a reacção
e mantêm a enzima permanentemente na forma de substrato unido) (Ibidem: 60)
Mecanismos enzimáticos
Os
mecanismos enzimáticos podem ser divididos em mecanismos de substrato único e
mecanismos de múltiplos substratos. Os estudos cinéticos com enzimas que apenas
unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase,
visam a medir a afinidade com
a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado,
ao estudar una enzima que une vários substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cinética enzimática pode mostrar também a ordem
pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos.
Nem
todas as catálises biológicas são efetuadas por enzimas proteicas. Existem moléculas
catalíticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e
a tradução do ARNm, respectivamente. A principal diferença entre as
ribozimas e os ribossomas radica no limitado número de reações que as primeiras
podem efetuar, embora os seus mecanismos de reacção e as suas cinéticas possam
ser estudados e classificados pelos mesmos métodos (Ibidem: 73).
Reacção catalisada
A reacção catalisada por uma enzima utiliza a mesma
quantidade de substrato e gera a mesma quantidade
de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre noutros tipos
de catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da
reacção entre substrato e produto. Ao contrário do que acontece noutras
reações químicas, as enzimas saturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de
substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que incrementará a
eficiência da reacção, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam
ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e,
embora se adicione mais substrato, não aumentará mais a eficiência (Ibidem:
75).
As
duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo
que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto
máximo de saturação. O conhecimento destas propriedades torna possível
formular hipóteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e
prever como responderá frente a mudanças nessas condições.
Ensaios enzimáticos
São
procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reações enzimáticas. Uma
vez que as enzimas não são consumidas pelas reações que catalisam, nos ensaios
seguem-se habitualmente mudanças na concentração de substratos ou produtos para
medir a taxa de reacção. Há vários métodos de medida: os ensaios espectrofotométricos
medem a mudança de absorbência da luz entre
produtos e reagentes; ensaios radiométricos envolvem a incorporação ou
libertação de radioatividade para medir a quantidade de produto que surge ao
longo do tempo. Os ensaios espectrofotométricos são mais convenientes pois
permitem a medição contínua da velocidade de reacção. Embora os ensaios
radiométricos exijam a remoção e contagem de amostras (ou seja, são ensaios
descontínuos), são habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vários
níveis da actividade enzimática. Uma abordagem análoga é usada na espectrometria de massa para
aferir a incorporação ou libertação de isótopos estáveis à
medida que o substrato é convertido em produto.
Os
ensaios enzimáticos mais sensíveis usam lasers focados por um microscópio para observar mudanças em moléculas enzimáticas
individuais à medida que decorre a reacção. Estas medidas usam geralmente
mudanças na fluorescência de cofactores durante
o mecanismo de reacção, ou fluoróforos adicionados a locais específicos da proteína que registam movimentos que ocorrem durante a
catálise. Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cinética e
dinâmica de moléculas individuais, em oposição à tradicional cinética
enzimática, que observa o comportamento médio de populações com milhões de
moléculas enzimáticas.
Fatores que afetam a
atividade das enzimas (Temperatura)
Temperatura: “A temperatura crítica para uma
enzima é aquela na qual a conformação da molécula é alterada, levando a
desnaturação proteica em consequente perda da função catalítica” (MASTOTROENI;
GERN, 2008: 56)
A temperatura é um
fator importante na atividade das enzimas. Dentro de certos limites, a velocidade
de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura. Entretanto, a
partir de uma determinada temperatura, a velocidade da reação diminui
bruscamente.
O aumento de
temperatura provoca maior agitação das moléculas e, portanto, maiores possibilidades
de elas se chocarem para reagir. Porém, se for ultrapassada certa temperatura,
a agitação das moléculas se torna tão intensa que as ligações que estabilizam a
estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.
Para cada tipo de
enzima existe uma temperatura ótima, na qual a velocidade da reação é máxima,
permitindo o maior número possível de colisões moleculares sem desnaturar a
enzima. A maioria das enzimas humanas, têm sua temperatura ótima entre 35 e
40ºC, a faixa de temperatura normal do nosso corpo. Já bactérias que vivem em
fontes de água quente têm enzimas cuja temperatura ótima fica ao redor de 70ºC.
Atividade
Enzimática
A atividade enzimática foi estudada por
Leonor Michaelis e Maus Menten, em 1913, dividindo o processo em duas etapas
que podem ser descritas conforme a equação a seguir: Inicialmente a enzima se
combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo
enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido. Em uma segunda
etapa lenta, o complexo ES então se quebra liberando a enzima livre, o produto
da reação (LEIHNINGER, 2002: 199).
Os organismos vivos são formados por coleções
de moléculas inanimadas que interagem entre si. O objetivo básico da Bioquímica
é mostrar como essas coleções de moléculas inanimadas interagem entre si,
mantendo e perpetuando os organismos vivos (animados), através da químicas
aplicada a um nível molecular.
Para a Bioquímica, todos os organismos vivos
(animados) são semelhantes em níveis moleculares e químicos. Assim, ela descreve
as estruturas, mecanismos e processos químicos compartilhado por todos os seres
existentes (inanimados e animados), comparando-os em termos moleculares,
formulando princípios organizacionais que fundamentam a Lógica Molecular da
Vida.
Um dos princípios organizacionais da
Bioquímica é a hierarquia molecular. Os seres vivos são constituídos por
células com diferentes funções. Todas as células, por sua vez, possuem uma
estrutura hierárquica semelhante: As células são divididas em complexos
supramoleculares; Estes complexos são subdivididos em macromoléculas
constituídas de biomoléculas, formadas a partir de subunidades monoméricas. Existem
quatro principais grupos de macromoléculas: Lipídios, carboidratos, ácidos
nucleicos e proteínas.
As proteínas são as macromoléculas mais
abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as
partes destas. As proteínas também ocorrem em grande variedade; as proteínas
também exibem uma grande diversidade de funções biológicas, sendo os produtos finais
mais importantes das vias de informação. Em um sentido, são os instrumentos
moleculares por meio dos quais a informação genética é expressa.” (LEIHNINGER,
2002: 89)
Além de estudar o processo envolvido durante
a reação, Michaelis e Menten criaram uma constante combinando: A velocidade
inicial e máxima de conversão do substrato em produto; a concentração de
enzima; e a concentração do substrato na solução. Ou seja: Quando a
concentração do substrato alcança a metade da velocidade máxima, encontramos a
constante. Vale ressaltar que a constante de Michaelis-Menten tem como papel
fundamental prever a quantidade de substrato e enzima para que a reação seja
eficaz.
Importância prática das
constantes cinéticas
O estudo da cinética enzimática é importante por duas
razões principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas
trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em
organismos vivos. As constantes cinéticas acima definidas, são críticas na
compreensão do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar
o metabolismo (LEHNINGER. 2002: 13).
Fazer
estas previsões não é trivial, mesmo para sistemas simples. A capacidade de
previsão de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua
concentração e da concentração e cinética de cada uma das enzimas. Esta
capacidade preditiva do comportamento metabólico atinge a sua expressão mais
complexa na síntese de grandes quantidades de dados cinéticos e genéticos em
modelos matemáticos de organismos inteiros.
Inibição enzimática
Os
inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a actividade das
enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversíveis (quando a
remoção do inibidor restaura a actividade enzimática) e os irreversíveis
(quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima).
Inibidores
reversíveis
Os
inibidores enzimáticos podem ser classificados como competitivos, a competitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam
nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este
efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato
ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar
correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cinética enzimática em função
da concentração de inibidor. Os quatro tipos de inibição dão lugar a diagramas
de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee que variam de diferente forma com a concentração
de inibidor. Para abreviar, usam-se dois símbolos:
y onde Ki e K'i são
as constantes de dissociação para se unir à enzima e ao complexo
enzima-substrato, respectivamente. Na presença de um inibidor reversível, os
valores aparentes deKm e Vmax passam a
ser (α/α')Km e (1/α')Vmax,
respectivamente. Os ajustes por regressão não linear dos
dados de cinética enzimática podem proporcionar estimativas muito precisas das
constantes de dissociação Ki e Ki'
(MARIOTTO. 2006: 31)
Inibidores
irreversíveis
Os
inibidores enzimáticos também se podem unir e inativar uma enzima de forma
irreversível, geralmente por meio de modificações covalentes de resíduos do
centro catalítico da enzima. Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis.
O modelo
de ajuste induzido é o mais utilizado em estudos de interação
enzima-substrato. Este modelo propõe que as interações iniciais entre a
enzima e o substrato são relativamente débeis, embora suficientes para produzir
certas mudanças estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a força
da interação. Estas mudanças de forma implicam uma série de aminoácidos catalíticos do centro ativo, nos quais se
produzem as ligações químicas correspondentes
entre a enzima e o substrato. Depois da união, um ou mais mecanismos de
catálise diminuem a energia do estado de transição da
reacção, por meio de uma via alternativa à reacção (Ibidem: 37).
Os estudos de cinética enzimática não permitem obter o
tipo de catálise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinéticos podem
proporcionar uma série de indícios que levem a realizar outro tipo de estudos
dirigidos a determinar certo tipo de catálise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cinética
do estado pré-estacionário poderá estar a sugerir uma catálise de tipo
covalente. Por outro lado, variações no pH podem
produzir efeitos drásticos em Vmax mas não em Km,
o que poderia indicar que um resíduo do centro ativo precisa um estado concreto
de ionização para que se
possa efetuar a catálise enzimática.
Conclusão
Chegado
ao fim deste trabalho, podemos notar durante o mesmo que o estudo das enzimas
são de grande importunância, não só para a bioquímica, mas para um conhecimento
de forma geral. O estudo da cinética enzimática permite por exemplo, explicar como as enzimas trabalham, e, em
complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As
constantes cinéticas acima definidas, são críticas na compreensão do modo de
funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo.
LEHNINGER,
Albert Lester. Lehninger princípios de bioquímica/David
L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo António Simões, Wilson Roberto
Navega Lodi. 3ed. São Paulo: SARVIER, 2002.
MARIOTTO,
Juliana Ribeiro. Cinética Enzimática.
Relatório acadêmico, 2006.
MASTROENI,
Marcos Fábio. Bioquímica: Práticas Adaptadas/Marcos
Fábio Mastroeni, Regina Maria Gern. São Paulo: Editora Atheneu, 2008.
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