Cinética Enzimática

Introdução

Falar de cinética enzimática, é o mesmo que falar das relações químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção. Quando nos fazemos um estudo sobre a cinética enzimática, nos permite elucidar os pormenores do mecanismo catalítico. Neste trabalho, falaremos da cinética enzimática, enzimas que são substâncias do grupo de proteínas e atuam como catalisadoras de reacção, mecanismos enzimáticos, reação catalisada, ensaios enzimáticos, factores que afetam a actividade das enzimas, Actividade Enzimática, Importância prática das constantes cinéticas, Inibição enzimática, Inibidores revertíveis, Inibidores irreversíveis.
  
Cinética Enzimática
cinética enzimática estuda as reações químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção. O estudo da cinética de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo catalítico, o seu papel no metabolismo, como é controlada a sua actividade na célula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro tipo de moléculas.
Enzimas
As enzimas são substâncias do grupo das proteínas e atuam como catalisadores de reações químicas. As enzimas são específicas para seus substratos, e o reconhecimento do substrato pela enzima é altamente eficiente (MASTOTROENI; GERN. 2008: 59).
Um substrato pode unir-se ao centro catalítico da enzima que o reconheça e transformar-se num produto ao longo de uma série de passos denominados mecanismo enzimático. Algumas enzimas podem unir vários substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como é o caso das próteses ao romper uma proteína em dois polipéptidos. Noutros casos, produz-se a união simultânea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que é capaz de incorporar um nucleótido  (substrato 1) a uma cadeia de ADN  (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa série de passos, também podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reacção. Este passo limitante pode consistir numa reacção química ou numa mudança de forma da enzima ou do substrato (Idem).
O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas é útil na interpretação dos dados cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catálise, que mudanças de forma ocorrem durante a reacção, ou mesmo o papel em particular de determinados aminoácidos no mecanismo catalítico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reacção, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se análogos que se unem mas não permitem levar a cabo a reacção e mantêm a enzima permanentemente na forma de substrato unido) (Ibidem: 60)

Mecanismos enzimáticos
Os mecanismos enzimáticos podem ser divididos em mecanismos de substrato único e mecanismos de múltiplos substratos. Os estudos cinéticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vários substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cinética enzimática pode mostrar também a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos.
Nem todas as catálises biológicas são efetuadas por enzimas proteicas. Existem moléculas catalíticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a tradução do ARNm, respectivamente. A principal diferença entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado número de reações que as primeiras podem efetuar, embora os seus mecanismos de reacção e as suas cinéticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos métodos (Ibidem: 73).

Reacção catalisada
reacção catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da reacção entre substrato e produto. Ao contrário do que acontece noutras reações químicas, as enzimas saturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que incrementará a eficiência da reacção, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e, embora se adicione mais substrato, não aumentará mais a eficiência (Ibidem: 75).
As duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto máximo de saturação. O conhecimento destas propriedades torna possível formular hipóteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responderá frente a mudanças nessas condições.

Ensaios enzimáticos
São procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reações enzimáticas. Uma vez que as enzimas não são consumidas pelas reações que catalisam, nos ensaios seguem-se habitualmente mudanças na concentração de substratos ou produtos para medir a taxa de reacção. Há vários métodos de medida: os ensaios espectrofotométricos medem a mudança de absorbência da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiométricos envolvem a incorporação ou libertação de radioatividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotométricos são mais convenientes pois permitem a medição contínua da velocidade de reacção. Embora os ensaios radiométricos exijam a remoção e contagem de amostras (ou seja, são ensaios descontínuos), são habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vários níveis da actividade enzimática. Uma abordagem análoga é usada na espectrometria de massa para aferir a incorporação ou libertação de isótopos estáveis à medida que o substrato é convertido em produto.
Os ensaios enzimáticos mais sensíveis usam lasers focados por um microscópio para observar mudanças em moléculas enzimáticas individuais à medida que decorre a reacção. Estas medidas usam geralmente mudanças na fluorescência de cofactores durante o mecanismo de reacção, ou fluoróforos adicionados a locais específicos da proteína que registam movimentos que ocorrem durante a catálise. Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cinética e dinâmica de moléculas individuais, em oposição à tradicional cinética enzimática, que observa o comportamento médio de populações com milhões de moléculas enzimáticas.

Fatores que afetam a atividade das enzimas (Temperatura)
Temperatura: “A temperatura crítica para uma enzima é aquela na qual a conformação da molécula é alterada, levando a desnaturação proteica em consequente perda da função catalítica” (MASTOTROENI; GERN, 2008: 56)
A temperatura é um fator importante na atividade das enzimas. Dentro de certos limites, a velocidade de uma reação enzimática aumenta com o aumento da temperatura. Entretanto, a partir de uma determinada temperatura, a velocidade da reação diminui bruscamente.
O aumento de temperatura provoca maior agitação das moléculas e, portanto, maiores possibilidades de elas se chocarem para reagir. Porém, se for ultrapassada certa temperatura, a agitação das moléculas se torna tão intensa que as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompem e ela se desnatura.
Para cada tipo de enzima existe uma temperatura ótima, na qual a velocidade da reação é máxima, permitindo o maior número possível de colisões moleculares sem desnaturar a enzima. A maioria das enzimas humanas, têm sua temperatura ótima entre 35 e 40ºC, a faixa de temperatura normal do nosso corpo. Já bactérias que vivem em fontes de água quente têm enzimas cuja temperatura ótima fica ao redor de 70ºC.
Atividade Enzimática
A atividade enzimática foi estudada por Leonor Michaelis e Maus Menten, em 1913, dividindo o processo em duas etapas que podem ser descritas conforme a equação a seguir: Inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido. Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES então se quebra liberando a enzima livre, o produto da reação (LEIHNINGER, 2002: 199).
Os organismos vivos são formados por coleções de moléculas inanimadas que interagem entre si. O objetivo básico da Bioquímica é mostrar como essas coleções de moléculas inanimadas interagem entre si, mantendo e perpetuando os organismos vivos (animados), através da químicas aplicada a um nível molecular.
Para a Bioquímica, todos os organismos vivos (animados) são semelhantes em níveis moleculares e químicos. Assim, ela descreve as estruturas, mecanismos e processos químicos compartilhado por todos os seres existentes (inanimados e animados), comparando-os em termos moleculares, formulando princípios organizacionais que fundamentam a Lógica Molecular da Vida.
Um dos princípios organizacionais da Bioquímica é a hierarquia molecular. Os seres vivos são constituídos por células com diferentes funções. Todas as células, por sua vez, possuem uma estrutura hierárquica semelhante: As células são divididas em complexos supramoleculares; Estes complexos são subdivididos em macromoléculas constituídas de biomoléculas, formadas a partir de subunidades monoméricas. Existem quatro principais grupos de macromoléculas: Lipídios, carboidratos, ácidos nucleicos e proteínas.
As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. As proteínas também ocorrem em grande variedade; as proteínas também exibem uma grande diversidade de funções biológicas, sendo os produtos finais mais importantes das vias de informação. Em um sentido, são os instrumentos moleculares por meio dos quais a informação genética é expressa.” (LEIHNINGER, 2002: 89)

Além de estudar o processo envolvido durante a reação, Michaelis e Menten criaram uma constante combinando: A velocidade inicial e máxima de conversão do substrato em produto; a concentração de enzima; e a concentração do substrato na solução. Ou seja: Quando a concentração do substrato alcança a metade da velocidade máxima, encontramos a constante. Vale ressaltar que a constante de Michaelis-Menten tem como papel fundamental prever a quantidade de substrato e enzima para que a reação seja eficaz.

Importância prática das constantes cinéticas
O estudo da cinética enzimática é importante por duas razões principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinéticas acima definidas, são críticas na compreensão do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo (LEHNINGER. 2002: 13).
Fazer estas previsões não é trivial, mesmo para sistemas simples. A capacidade de previsão de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentração e da concentração e cinética de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metabólico atinge a sua expressão mais complexa na síntese de grandes quantidades de dados cinéticos e genéticos em modelos matemáticos de organismos inteiros.
Inibição enzimática
Os inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversíveis  (quando a remoção do inibidor restaura a actividade enzimática) e os irreversíveis  (quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima).
Inibidores reversíveis
Os inibidores enzimáticos podem ser classificados como competitivos, a competitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cinética enzimática em função da concentração de inibidor. Os quatro tipos de inibição dão lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee que variam de diferente forma com a concentração de inibidor. Para abreviar, usam-se dois símbolos:
{\displaystyle \alpha =1+{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}}}} y {\displaystyle \alpha ^{\prime }=1+{\frac {[{\mbox{I}}]}{K_{i}^{\prime }}}}onde Ki e K'i são as constantes de dissociação para se unir à enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presença de um inibidor reversível, os valores aparentes deKm e Vmax passam a ser (α/α')Km e (1/α')Vmax, respectivamente. Os ajustes por regressão não linear dos dados de cinética enzimática podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de dissociação Ki e Ki' (MARIOTTO. 2006: 31)

Inibidores irreversíveis
Os inibidores enzimáticos também se podem unir e inativar uma enzima de forma irreversível, geralmente por meio de modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis.
modelo de ajuste induzido é o mais utilizado em estudos de interação enzima-substrato. Este modelo propõe que as interações iniciais entre a enzima e o substrato são relativamente débeis, embora suficientes para produzir certas mudanças estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a força da interação. Estas mudanças de forma implicam uma série de aminoácidos catalíticos do centro ativo, nos quais se produzem as ligações químicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da união, um ou mais mecanismos de catálise diminuem a energia do estado de transição da reacção, por meio de uma via alternativa à reacção (Ibidem: 37).
Os estudos de cinética enzimática não permitem obter o tipo de catálise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinéticos podem proporcionar uma série de indícios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catálise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cinética do estado pré-estacionário poderá estar a sugerir uma catálise de tipo covalente. Por outro lado, variações no pH podem produzir efeitos drásticos em Vmax mas não em Km, o que poderia indicar que um resíduo do centro ativo precisa um estado concreto de ionização para que se possa efetuar a catálise enzimática.
  
Conclusão
Chegado ao fim deste trabalho, podemos notar durante o mesmo que o estudo das enzimas são de grande importunância, não só para a bioquímica, mas para um conhecimento de forma geral. O estudo da cinética enzimática permite por exemplo, explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinéticas acima definidas, são críticas na compreensão do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo.

LEHNINGER, Albert Lester. Lehninger princípios de bioquímica/David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo António Simões, Wilson Roberto Navega Lodi. 3ed. São Paulo: SARVIER, 2002.
MARIOTTO, Juliana Ribeiro. Cinética Enzimática. Relatório acadêmico, 2006.

MASTROENI, Marcos Fábio. Bioquímica: Práticas Adaptadas/Marcos Fábio Mastroeni, Regina Maria Gern. São Paulo: Editora Atheneu, 2008.

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